Un appareil de diagnostic microfluidique avec prise d'air

Dec 24, 2023

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 12852 (2022) Citer cet article

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L'identification de la contamination accidentelle par des allergènes dans les aliments transformés est cruciale pour les stratégies de gestion des risques dans l'industrie de la transformation des aliments afin de prévenir efficacement les incidents d'allergie alimentaire. Ici, nous proposons une vanne d'arrêt passive nouvellement conçue avec des performances de résistance à haute pression appelée "vanne enfichable d'air" pour améliorer encore les dispositifs microfluidiques pour la détection des acides nucléiques cibles. En mettant en œuvre la vanne enfichable d'air comme vanne d'arrêt permanente, un débit maximal autorisé de 70 µL/min pourrait être atteint pour la distribution séquentielle de liquide dans un réseau de 10 microchambres, ce qui est 14 fois supérieur à celui obtenu avec l'agencement de vannes précédent utilisant des vannes d'arrêt à simple face. De plus, nous démontrons la détection simultanée de plusieurs allergènes alimentaires (blé, sarrasin et arachide) basée sur le test d'amplification isotherme à boucle colorimétrique à l'aide de notre appareil de diagnostic avec 10 microchambres disposées de manière compacte dans un cercle de 20 mm de diamètre. Après avoir exécuté les tests à 60 ° C pendant 60 min, toute combinaison des trois types d'allergènes alimentaires et de théier, qui ont été utilisés comme échantillons de contrôle positifs et négatifs, respectivement, a donné des résultats de test corrects, sans aucune contamination croisée entre les microchambres. Ainsi, notre appareil de diagnostic fournira une plate-forme échantillon-réponse rapide et facile pour assurer la sécurité alimentaire.

Les allergies alimentaires sont des réactions indésirables à médiation immunitaire déclenchées par l'inhalation ou l'ingestion de protéines dans des aliments spécifiques1,2,3. Les taux d'incidence et de prévalence des allergies alimentaires ont augmenté au cours des dernières décennies, posant un problème de santé mondial. Les allergènes peuvent provoquer non seulement des réactions allergiques aiguës, telles que la peau (urticaire), les voies respiratoires (respiration sifflante, toux) et le tractus gastro-intestinal (nausées, vomissements et diarrhée), mais aussi des conditions critiques, telles que l'anaphylaxie4,5. À l'heure actuelle, l'étiquetage des allergènes alimentaires est obligatoire et légiféré dans de nombreux pays. Au Japon, des réglementations sur l'étiquetage des allergènes alimentaires ont été adoptées pour les aliments transformés contenant sept matières premières spécifiques, notamment le blé, le sarrasin, l'arachide, l'œuf, le lait, les crevettes et le crabe. Les lignes directrices stipulent que tout aliment contenant des protéines allergènes doit être étiqueté si la concentration dépasse 10 mg/kg (ppm)6. Pour les consommateurs allergiques aux aliments, même une infime quantité d'un allergène peut induire une réaction allergique7. Par conséquent, l'identification rapide et facile des aliments transformés accidentellement contaminés par des substances allergènes est cruciale pour les stratégies de gestion des risques dans l'industrie de la transformation des aliments afin de prévenir efficacement les incidents d'allergie alimentaire.

De nombreuses méthodes de détection de divers allergènes alimentaires ont été évaluées8. Le dosage immuno-enzymatique (ELISA) est largement utilisé pour l'analyse quantitative des protéines ciblées en raison de ses avantages de sensibilité élevée, de spécificité élevée, de facilité d'utilisation et de débit élevé d'échantillons. En conséquence, c'est l'un des tests les plus couramment utilisés pour détecter et quantifier les allergènes alimentaires dans l'industrie alimentaire et dans les agences officielles de contrôle des aliments9,10. Plusieurs kits de tests immunodiagnostiques basés sur ELISA sont disponibles dans le commerce pour la détection des allergènes alimentaires11,12,13. Cependant, les protéines sont susceptibles de subir une dégradation protéolytique involontaire au cours des processus d'extraction utilisés dans les méthodes de détection à base de protéines, ce qui peut entraîner des résultats faussement négatifs, et les matrices alimentaires complexes peuvent contenir des composants organiques interférents, ce qui peut donner lieu à des faux positifs14,15. Étant donné que les molécules d'ADN sont plus stables que les protéines, les méthodes de détection basées sur les acides nucléiques, parmi lesquelles la réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel (qPCR) est la méthode la plus largement utilisée pour amplifier des cibles spécifiques d'acide nucléique (ADN/ARN), sont de plus en plus utilisées dans la détection des allergènes alimentaires16,17,18,19. Cependant, les tests qPCR nécessitent un personnel hautement qualifié et un équipement coûteux (c'est-à-dire un thermocycleur) avec un contrôle précis du point de consigne de température pour l'amplification et ne constituent donc pas un outil de détection rentable et facile à utiliser.

L'amplification isotherme médiée par boucle (LAMP) a été reconnue comme une alternative à la qPCR pour la détection sur site sans nécessiter d'équipement spécialisé20,21. Le test LAMP, dans lequel un ensemble de quatre à six amorces LAMP spécialement conçues et de l'ADN polymérase Bst avec une activité de déplacement de brin élevée sont utilisés pour amplifier une cible ADN spécifique, peut être effectué en 30 à 60 min dans des conditions isothermes (60 à 65 ° C)22,23. Diverses méthodes de détection des produits d'amplification LAMP sont disponibles, telles que la visualisation des produits d'amplification par électrophorèse sur gel traditionnelle après amplification, la mesure en temps réel de la turbidité causée par le pyrophosphate de magnésium produit en tant que sous-produit de réaction et la détection en temps réel des amplicons LAMP à l'aide d'un colorant fluorescent intercalant (par exemple, SYBR Green I). De plus, une détection colorimétrique à l'œil nu à l'aide de colorants indicateurs est possible. Par exemple, le rouge de phénol est un colorant indicateur sensible au pH utilisé pour surveiller les changements de pH significatifs d'alcalin à acide associés à la réaction LAMP et le bleu d'hydroxynaphtol (HNB) est un colorant indicateur métallique utilisé pour surveiller une diminution rapide de la concentration d'ions Mg2+ libres en raison de la formation de pyrophosphate de magnésium insoluble pendant l'amplification de l'ADN24,25,26. Cependant, il reste des problèmes fondamentaux avec la méthode LAMP conventionnelle qui restent à résoudre pour son application dans le diagnostic multiplexé sur site de plusieurs allergènes alimentaires. Autrement dit, il est nécessaire de préparer et de tester individuellement de nombreux mélanges d'échantillons/réactifs pour chaque cible d'allergènes alimentaires. Cette procédure nécessite non seulement une préparation d'échantillon longue et fastidieuse pour obtenir un résultat de test, mais également une quantité relativement importante de réactifs LAMP, généralement de 10 à 25 µL pour tester un seul allergène alimentaire. Pour répondre à ces préoccupations, les technologies Lab-on-a-chip ont un potentiel considérable pour permettre des tests LAMP multiplexés dans des dispositifs microfluidiques pour la détection simultanée d'acides nucléiques ciblés en une seule opération27,28,29,30,31,32,33,34.

Dans nos études précédentes35,36,37, nous avons développé un dispositif microfluidique polyvalent pour la détection multiplexée d'acides nucléiques ciblés basé sur la méthode LAMP. Le dispositif microfluidique permet la distribution séquentielle de mélanges échantillon/réactif dans un ensemble de microchambres de réaction en une seule opération, fournissant ainsi éventuellement une plate-forme pour des diagnostics échantillon-réponse rapides et faciles. Dans le but de minimiser les pertes de récoltes et d'assurer un approvisionnement stable en nourriture abordable dans l'agriculture, nous avons démontré la capacité du dispositif de diagnostic fabriqué à détecter non seulement un virus végétal à ADN infectant la tomate, mais également quatre virus végétaux à ARN infectant les cucurbitacées en 60 min35. De plus, nous avons démontré que la plante toxique Colchicum autumnale pouvait être détectée en 60 minutes pour fournir une méthode de dépistage fiable pour l'empoisonnement des plantes dans les soins médicaux d'urgence36. De plus, nous pouvons diagnostiquer simultanément la maladie à coronavirus et d'autres maladies infectieuses, y compris celles causées par le syndrome respiratoire aigu sévère, la grippe saisonnière A et la grippe pandémique A 2009, en exécutant un test LAMP de transcription inverse colorimétrique pendant 30 minutes à l'aide de notre appareil microfluidique37. Cependant, dans le procédé de distribution séquentielle de liquide précédemment proposé, le débit maximal admissible pour la distribution de plusieurs microchambres est limité par une augmentation de la résistance à l'écoulement, qui augmente proportionnellement non seulement au débit, mais également au nombre de microchambres remplies. Dans cette étude, nous avons conçu une nouvelle configuration de vanne à utiliser comme vanne d'arrêt permanente (ci-après dénommée "vanne enfichable d'air") dans le dispositif de diagnostic microfluidique dans le but d'améliorer considérablement les performances de la distribution séquentielle de liquide dans un réseau de microchambres de réaction. La caractéristique la plus distinctive de la vanne enfichable d'air proposée ici est que les liquides atteignant un ensemble de deux vannes passives se poussent l'un contre l'autre à travers le bouchon d'air, ce qui entraîne des performances de résistance à haute pression car la pression appliquée est décalée. À l'aide d'un dispositif microfluidique conçu de manière optimale avec 10 microchambres disposées en cercle, nous démontrons la détection simultanée de trois allergènes alimentaires basés sur des cibles ADN spécifiques de blé (Triticum aestivum), de sarrasin (Fagopyrum esculentum) et d'arachide (Arachis hypogaea).

Nous avons développé un procédé de fabrication d'un dispositif microfluidique à base de polydiméthylsiloxane (PDMS) utilisé pour la détection génétique multiplexée, combinant un procédé de lithographie douce et un procédé de refusion de cire38. La figure 1a montre un exemple du dispositif microfluidique fabriqué (d'une taille de 50 mm × 25 mm) composé de deux parties principales : une région de mélange et une région de distribution, qui servent également de régions de réaction et de détection. Cinq microchambres dans un réseau sont interconnectées via deux microcanaux rectangulaires indépendants (200 um de largeur et 50 um de hauteur) pour introduire le liquide dans les microchambres et pour évacuer l'air dans les microchambres, respectivement.

Représentation schématique du dispositif de diagnostic microfluidique permettant la distribution séquentielle de liquide pour la détection d'allergènes génétiques multiplexés et fabriqué à l'aide d'une combinaison d'un processus de lithographie douce et d'un processus de refusion de cire. (a) Un dispositif microfluidique PDMS fabriqué composé d'un réseau de cinq microchambres de réaction (~ 3 µL chacune) a été rempli d'eau de couleur verte. (b) Un morceau de cire a été placé sur la surface supérieure de chaque modèle de moule de chambre SU-8. ( c ) Moules en cire de forme semi-ellipsoïdale formés avec une forme uniforme après chauffage à 135 ° C pendant 3 min. ( d ) Images de microscopie électronique à balayage de la microchambre PDMS. (e) Image 3D et profils en coupe transversale de la microchambre PDMS.

Le processus de fabrication utilisé peut être brièvement décrit comme suit : premièrement, un photorésist épais négatif (SU-8 3050 ; MicroChem, Newton, MA, États-Unis) a été modelé sur une plaquette de silicium monocristallin de 4 pouces (e-Prize, Yokohama, Japon) en tant que moule dans un processus de photolithographie en une seule étape. Ensuite, pour créer des structures de microchambres localisées profondes (max. 1 mm de profondeur), le moule SU-8 et des morceaux de cire de 2,7 mg (Ferris File-A-Wax; Freeman Manufacturing & Supply, Avon, OH, USA) ont été simultanément soumis à un traitement de surface au plasma d'air à basse pression dans un plasma Asher (JPA300; J-Science Lab, Kyoto, Japon) à une puissance de 150 W pendant 2 min. Ensuite, les morceaux de cire ont été placés au centre de la surface supérieure de chaque modèle de chambre SU-8 (Fig. 1b). Par la suite, un processus de refusion a été effectué en chauffant le moule contenant les morceaux de cire sur une plaque chauffante à 135 ° C pendant 3 min (EC1200-N ; AS ONE, Osaka, Japon). Après refroidissement à température ambiante, des moules à chambre en forme de demi-ellipse de forme uniforme ont été obtenus en raison de la tension superficielle de la cire fondue (Fig. 1c). Il convient de noter que le traitement de surface au plasma du moule SU-8 et des morceaux de cire avant le processus de refusion a remarquablement amélioré la force d'adhérence entre eux, probablement en raison de l'élimination des contaminations de surface. Par la suite, le moule maître SU-8 avec les structures de cire semi-elliptiques a été reproduit dans du PDMS (Silpot 184 ; Dow Corning Toray, Tokyo, Japon) après durcissement sur une plaque chauffante à 80 °C pendant 40 min. Après avoir décollé le PDMS du moule maître SU-8, des trous circulaires (d'un diamètre de 1,0 mm) pour une entrée et deux orifices de sortie ont été percés dans le dispositif microfluidique PDMS à l'aide d'un outil de perforation de biopsie (Kai Industries, Gifu, Japon). Enfin, les microchambres et les microcanaux ont été scellés avec une feuille blanche de chlorure de polyvinyle (PVC) (EB-235 ; Hikari, Osaka, Japon) à l'aide d'un ruban adhésif double face à base de silicone (n° 5303 W ; Nitto Denko, Osaka, Japon). La figure 1d montre des images d'une microchambre PMDS acquises avec un microscope électronique à balayage (S-3000 N; Hitachi High-Tech, Tokyo, Japon). Une microchambre PDMS tridimensionnelle (3D) avec une surface incurvée extrêmement lisse a été obtenue. Une image 3D et des profils en coupe de la microchambre PDMS acquises avec un microscope numérique (VHX-7000; Keyence, Osaka, Japon) ont révélé que la profondeur maximale de la microchambre semi-elliptique PDMS était d'environ 1 mm, la valeur de conception attendue (Fig. 1e).

Dans cette étude, des dispositifs microfluidiques avec 10 microchambres disposées en une seule rangée ou en cercle ont également été fabriqués par le même processus. De plus, pour étudier l'effet des fuites d'air à l'interface du dispositif PDMS et du ruban adhésif double face à base de silicone, nous avons préparé un dispositif PDMS modifié qui a été lié de manière covalente à une fine couche de PDMS enduite par centrifugation sur une plaquette de verre de 4 pouces (AS-4; Toshin Riko, Tokyo, Japon) par traitement de surface au plasma d'air. Dans les expériences, une pompe à seringue (YSP-201; YMC, Kyoto, Japon) ou une micropompe à pression (Flow EZ 7000 mbar, Fluigent SA, Le Kremlin-Bicêtre, France) équipée d'un capteur de débit (Flow Unit, Fluigent SA) ont été utilisées pour introduire le liquide dans les dispositifs. Une caméra de smartphone a été utilisée pour capturer des images vidéo du processus séquentiel de distribution de liquide dans plusieurs microchambres et des photographies de plusieurs microchambres pour analyser le changement de couleur après les tests LAMP.

Dans notre étude précédente37, nous avons introduit une méthode de distribution séquentielle de liquide dans plusieurs microchambres de réaction en contrôlant les pressions d'éclatement dans une paire de vannes d'arrêt passives intégrées dans chaque microchambre (Fig. 2). En bref, la procédure de distribution était la suivante : premièrement, le flux de liquide s'arrête après avoir atteint la vanne d'arrêt passive S1 (conçue avec une pression d'éclatement P1), qui agit comme une vanne d'arrêt temporaire, et est redirigé vers la microchambre. Une fois la microchambre remplie de liquide, le débit de liquide est arrêté au niveau de la vanne d'arrêt passive S2 (conçue avec une pression d'éclatement P2), qui agit comme une vanne d'arrêt permanente, puis le liquide s'écoule vers la deuxième microchambre en passant par la vanne S1 car P1 < P2. La vanne S2 permet également d'évacuer l'air des microchambres. Toutes les microchambres peuvent être séquentiellement remplies de liquide en répétant ce processus. Dans le processus de distribution, le nombre possible de microchambres distribuées et le débit maximal autorisé peuvent être théoriquement conçus par la théorie de distribution séquentielle de liquide que nous avons suggérée et qui est décrite par l'équation suivante :

où ΔP(L1), ΔP(L2) et ΔP(L3) sont les différences de pression nécessaires pour faire circuler un liquide dans des microcanaux de longueurs caractéristiques L1, L2 et L3, respectivement, et m est le nombre de microchambres qui ont été entièrement remplies. Les définitions de L1, L2 et L3 sont données dans la section suivante. La résistance à l'écoulement à l'intérieur de la microchambre n'est pas prise en compte car la microchambre est considérablement plus grande dans l'espace que les microcanaux. La perte de charge théorique ΔP(L) dans un microcanal rectangulaire est donnée par l'équation suivante39 :

où W, H et L sont respectivement la largeur, la hauteur et la longueur du microcanal, η est la viscosité dynamique du liquide (η = 1 mPa·s pour l'eau) et Q est le débit volumétrique.

Représentation schématique d'une méthode de distribution séquentielle de liquide dans plusieurs microchambres de réaction. (a) Conception détaillée de microchambres avec une paire de vannes d'arrêt à simple face avec différentes pressions d'éclatement. (b) Image en microscopie optique de la vanne d'arrêt permanent S2. (c) Image en microscopie optique de la vanne d'arrêt temporaire S1.

Selon la théorie de la distribution (Eq. 1), pour augmenter le débit pour un même nombre possible de microchambres distribuées, il faut réduire la longueur du microcanal, notamment L1, diminuer la pression d'éclatement P1 de la vanne d'arrêt temporaire S1, et augmenter la pression d'éclatement P2 de la vanne d'arrêt permanent S2, réduisant ainsi le temps nécessaire à la distribution de liquide dans les microchambres. La pression d'éclatement théorique, P(g) (Pa), de la vanne S1 est décrite comme suit37 :

où g est l'espace entre la paroi latérale verticale du microcanal et la structure convexe encastrée sur la paroi latérale opposée (ci-après dénommée "vanne d'arrêt simple face"), H est la hauteur du microcanal, θm est l'angle de contact avec l'eau pour les surfaces supérieure et latérale du microcanal à un espace étroit (θm = 108° pour le PDMS), θf est l'angle de contact avec l'eau pour la surface inférieure du microcanal (θf = 102° pour l'adhésif à base de silicone ruban adhésif double face), et γ est la tension superficielle du liquide (γ = 0,073 N/m pour l'eau). Lorsque le rayon d'angle r au bord arrière de la structure convexe n'est pas négligeable, le dénominateur g + r (1 ‒ cos β) dans le premier terme est la distance d'écart redéfinie entre une certaine position sur l'angle à un angle β et la paroi latérale verticale du microcanal, où β est l'angle entre la direction perpendiculaire à la direction longitudinale du microcanal et la position du ménisque liquide-air correspondant à l'épinglage au coin de la structure convexe. Dans cette étude, nous avons étudié des configurations de vanne nouvellement conçues pour la vanne d'arrêt permanent S2 afin d'améliorer les performances de résistance à la pression. Nous avons analysé les performances théoriques et expérimentales de la distribution séquentielle de liquide dans un ensemble de microchambres en mettant en œuvre une vanne d'arrêt à double face ou une vanne à prise d'air (les conceptions des deux vannes sont décrites en détail dans la section suivante) et les avons comparées à celle de la vanne d'arrêt à simple face rapportée dans notre étude précédente37.

Le but de cette étude était d'introduire une plate-forme échantillon-réponse rapide et facile pour la détection multiplexée de plusieurs allergènes dans les aliments transformés en une seule opération. Nous avons exploré la possibilité de la détection simultanée de trois cibles d'ADN spécifiques du blé, du sarrasin et de l'arachide à l'aide de notre dispositif de diagnostic microfluidique nouvellement conçu avec 10 microchambres disposées en cercle. Le mode opératoire du test LAMP colorimétrique multiplexé dans le dispositif de diagnostic microfluidique pour la détection génétique simultanée des trois allergènes est le suivant (Fig. S1 supplémentaire) : premièrement, 0,5 µL de trois jeux d'amorces spécifiques destinés à amplifier les gènes d'allergènes végétaux ciblés (n° 2 et 7 pour le blé ; n° 3 et 8 pour le sarrasin ; et n° 4 et 9 pour l'arachide) et 0,5 µL de jeux d'amorces universels pour identifier tous les espèces végétales en tant que contrôle positif (n ° 5 et 10) ont été pré-tachées et séchées dans chaque chambre de réaction (volume ≈ 3 µL) sur une plaque chauffante à 80 ° C pendant 3 min. Par la suite, les microchambres et les microcanaux sur la surface du PDMS ont été scellés avec une feuille de PVC à l'aide d'un ruban adhésif double face à base de silicone. Après avoir distribué un mélange d'échantillon d'ADN et de réactifs LAMP dans les multiples chambres de réaction à un débit de 30 µL/min à l'aide de la pompe à seringue, les orifices d'entrée et de sortie ont été scellés avec un ruban adhésif double face à base de silicone ainsi qu'un revêtement antiadhésif en polyéthylène téréphtalate d'un côté. Ici, la doublure anti-adhésive est laminée des deux côtés pour recouvrir les couches adhésives du ruban adhésif double face. Le dispositif microfluidique a ensuite été clipsé mécaniquement entre deux plaques de verre (S9213; Matsunami Glass, Osaka, Japon) placées des deux côtés du dispositif pour éviter les fuites aux interfaces entre la feuille de PVC, le PDMS et la doublure de libération en polyéthylène téréphtalate. Pour éviter la déformation du dispositif par le clippage mécanique, le dispositif PDMS a été pris en sandwich entre deux plaques de verre supplémentaires. Enfin, l'appareil a été immergé dans un bain d'eau chaude (TB-2N; AS ONE, Osaka, Japon) pour amplifier l'ADN cible par la réaction LAMP dans des conditions isothermes à 60 ° C pendant 60 min.

HNB (FUJIFILM Wako Pure Chemical, Osaka, Japon) a été utilisé comme indicateur pour la détection colorimétrique visible de la réaction LAMP et pour l'analyse d'image pour la quantification de la couleur du point final. Dans notre étude précédente37, nous avons développé une méthode pour évaluer quantitativement les différences de couleur entre une réaction positive (bleu ciel) et une réaction négative (violet) après les tests LAMP, basée sur une représentation de l'espace colorimétrique CIE L*a*b* (CIELAB). Dans l'espace colorimétrique CIELAB, L* indique la luminosité et a* et b* sont les coordonnées de chromaticité. En bref, tout d'abord, les valeurs RVB pour chaque microchambre ont été quantifiées à l'aide d'ImageJ (version 1.52a, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) à partir de photographies prises avec un appareil photo de smartphone et ensuite converties en valeurs tristimulus XYZ dans l'espace colorimétrique CIE XYZ. Les valeurs des paramètres de couleur L*, a* et b* ont été calculées à l'aide des valeurs XYZ. Cette méthode de calcul a été précédemment décrite en détail40. HNB a été ajouté au mélange d'échantillon d'ADN et de réactifs LAMP dans chaque chambre de réaction à une concentration finale de 150 uM. Le kit d'amplification d'ADN Loopamp (Eiken Chemical, Tokyo, Japon), comprenant un mélange réactionnel 2 × et une ADN polymérase Bst thermostable, a été utilisé pour effectuer les réactions LAMP. L'ADN a été extrait du blé, du sarrasin, de l'arachide et du théier (Camellia sinensis; utilisé comme contrôle négatif) à l'aide d'un kit TaKaRa NucleoSpin Plant II (Takara Bio, Shiga, Japon) et a été quantifié à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis). Quatre échantillons de plantes, dont T. aestivum (voucher n° JU2021TA10), F. esculentum (voucher n° JU2021FE11), A. hypogaea (voucher n° JU2021AH12) et C. sinensis (voucher n° JU2021CS13) ont été obtenus du jardin botanique de l'Université de Josai. Tous les spécimens ont été déposés au jardin botanique de l'Université Josai.

Dans nos études précédentes35,36,37, nous avons utilisé des billes de polymère hémisphériques (2 mm de diamètre; SAYAKOBO, Yokohama, Japon) pour créer des structures de microchambres localisées profondes au lieu du processus de refusion de cire (Fig. S2 supplémentaire). Les billes de polymère ont été collées manuellement sur chaque motif de chambre SU-8 en tant que moule à l'aide d'un adhésif époxy (Araldite; Huntsman Japon, Kobe, Japon) à température ambiante pendant 12 h. Ce processus de fabrication a conduit à une faible reproductibilité des microchambres, c'est-à-dire que la faible contrôlabilité de l'épaisseur de la couche adhésive et l'excès d'adhésif étant pressé à l'interface de collage ont diminué la précision de la réplication, en particulier à l'intersection du microcanal et de l'entrée de la microchambre. De tels échecs de processus ont parfois conduit à des bulles d'air inattendues emprisonnées dans la microchambre (Fig. 3a). Ce résultat défavorable a très probablement été causé par un écoulement non uniforme sur une marche ou autour d'un obstacle à l'entrée de la microchambre. La probabilité de distribution d'échantillons sans bulles d'air était de 87,0 % dans des expériences avec 20 appareils et un total de 100 chambres. En mettant en œuvre le processus de refusion thermique utilisant de la cire, la probabilité de distribution sans bulles d'air a été nettement améliorée jusqu'à 100 % dans des expériences avec 20 appareils et un total de 100 chambres (Fig. 3b).

Comparaison des comportements de distribution de liquide entre les microchambres PDMS fabriquées en utilisant (a) des billes de polymère hémisphériques et (b) le processus de refusion de cire. Les premiers présentaient occasionnellement des bulles d'air inattendues emprisonnées dans les microchambres, contrairement aux seconds.

Dans cette étude, nous avons amélioré les performances de résistance à la pression de la vanne S2 en modifiant sa configuration géométrique. Comme le montre la figure 4a, la distance d'espacement de la vanne S2 est déterminée par deux structures convexes se faisant face, intégrées sur les deux parois latérales du microcanal (appelée vanne d'arrêt capillaire 41). Dans nos dispositifs, la structure de vanne de S2 est ci-après appelée vanne d'arrêt à double face, tandis que la vanne S1 est une vanne d'arrêt à simple face. La pression d'éclatement théorique de la soupape d'arrêt à double face peut être dérivée comme suit :

Résultats expérimentaux montrant l'effet du débit sur les performances de distribution séquentielle de liquide dans un réseau de 10 microchambres avec vannes d'arrêt double face. (a) Conception détaillée des microchambres de réaction avec une paire de vannes d'arrêt passives comprenant une vanne d'arrêt simple face comme vanne d'arrêt temporaire S1 et une vanne d'arrêt double face comme vanne d'arrêt permanente S2. Les microchambres ont été remplies séquentiellement d'eau de couleur bleue à un débit de (b) 10, (c) 20 ou (d) 50 µL/min.

La distance d'écartement de la vanne d'arrêt à double face S2 a été mesurée expérimentalement comme étant g2 = 21,4 μm (Fig. 4), ce qui donne une pression d'éclatement théorique P2 de 5,85 kPa pour r2 = 6,4 μm dans un microcanal (W = 202,1 μm et H = 59,0 μm). La pression d'éclatement théorique de la vanne d'arrêt simple face avec la même distance d'espacement (g2 = 21,4 μm) a été calculée comme étant P2 = 4,47 kPa. Ainsi, la pression d'éclatement peut être augmentée de 1,3 fois par rapport à celle de la vanne d'arrêt simple face en mettant en œuvre la vanne d'arrêt double face pour S2. Il convient de noter que cinq paires de S2 ont été disposées en série (Fig. 4a) car nous avons supposé que la distance d'écartement (g2) et/ou le rayon d'angle (r2) d'une ou plusieurs vannes ne seraient pas la valeur de conception en raison d'échecs de processus inattendus en lithographie douce. Ainsi, celle des cinq vannes qui a la pression d'éclatement la plus élevée (P2) détermine la limite de performance réelle de la vanne dans les dispositifs microfluidiques. A titre de comparaison, la distance d'espacement g1 de 40,5 μm pour la vanne d'arrêt simple face S1 a entraîné une pression d'éclatement théorique P1 de 2,79 kPa. Les longueurs de microcanaux L1, L2 et L3 ont été fixées à 5, 0 mm, 1, 0 mm, 0, 2 mm, comme indiqué sur la figure 4a.

La figure 4b montre qu'un réseau de 10 microchambres a été complètement rempli d'eau colorée avec du colorant alimentaire bleu (0,1 % w/v) lorsque nous avons utilisé la micropompe à pression à un débit de 10 µL/min. Comme prévu, le nombre possible de microchambres distribuées lors de l'utilisation de la vanne d'arrêt à double face S2 a été multiplié par 1,7 par rapport aux six microchambres qui pouvaient être obtenues au même débit avec la vanne d'arrêt à simple face S2 utilisée précédemment37. Cependant, comme prédit par le modèle de distribution théorique, le nombre possible de microchambres distribuées a diminué à cinq et deux lorsque le débit a été augmenté à 20 µL/min (Fig. 4c et Vidéo S1) ou 50 µL/min (Fig. 4d), respectivement.

Selon la théorie de la distribution décrite dans les équations. (1–4), le débit maximal admissible est limité par une augmentation de la résistance à l'écoulement ΔP(L1), qui augmente proportionnellement non seulement au débit, mais aussi au nombre de microchambres remplies. Lors de l'utilisation des dimensions géométriques des microcanaux et d'une paire de vannes d'arrêt passives telles que conçues dans cette étude, le débit maximal autorisé pour la distribution de 10 microchambres était limité à environ 10 µL/min. Il convient de noter qu'une réduction supplémentaire de la distance d'écart (g2 = 20 µm comme valeur de conception) de la vanne d'arrêt permanente S2 améliorerait la résistance à la pression (P2), mais affecterait négativement la précision de la structuration du moule SU-8 par photolithographie.

Par conséquent, nous proposons une configuration de vanne nouvellement conçue pour la vanne d'arrêt permanent, que nous avons appelée "vanne enfichable d'air". Comme le montre la figure 5a, un ensemble de deux vannes d'arrêt à double face S2 a été placé en aval et en amont dans le microcanal supérieur (ci-après dénommé microcanal d'échappement d'air) pour évacuer l'air dans les microchambres. Cinq paires de S2 ont été disposées en série pour éviter le risque de défaillances inattendues dans le processus de fabrication comme mentionné dans la section précédente. La caractéristique la plus distinctive de la valve enfichable d'air proposée ici est que l'air est emprisonné dans la partie du microcanal d'échappement d'air reliant deux valves S2 de microchambres voisines lorsque la microchambre suivante est complètement remplie de liquide (Fig. 5a). Par exemple, les deux vannes S2 de la première microchambre sont soumises à la pression totale indiquée sur le côté droit de l'Eq. (5a) pendant que la seconde microchambre est remplie de liquide. Cette condition correspond au cas où m = 1 dans l'Eq. (1), et la pression appliquée aux vannes S2 atteint le maximum juste avant que le liquide n'atteigne les vannes S2 de la deuxième microchambre. Cependant, une fois que le piégeage d'air entre les vannes S2 des première et deuxième microchambres est terminé, la pression appliquée aux vannes S2 de la première microchambre diminue jusqu'à la pression indiquée sur le côté droit de l'Eq. (5b) parce que les liquides atteignant les deux vannes se poussent l'un contre l'autre à travers le bouchon d'air, ce qui entraîne le décalage de la pression appliquée.

Résultats expérimentaux montrant l'effet du débit sur les performances de la distribution séquentielle de liquide dans un réseau de 10 microchambres avec des vannes à prise d'air. (a) Conception détaillée des microchambres de réaction avec la vanne d'enfichage d'air comme vanne d'arrêt permanente S2, consistant en un ensemble de deux vannes d'arrêt à double face se faisant face dans le microcanal d'échappement d'air. Les microchambres ont été remplies séquentiellement d'eau de couleur verte à un débit de (b) 10, (c) 30 ou (d) 70 µL/min. LL sur les photographies correspond à la longueur de fuite.

On peut en conclure que la pression d'éclatement P2 des vannes d'arrêt permanent S2 doit être conçue uniquement pour satisfaire la contrainte donnée par l'Eq. (5a), c'est-à-dire qu'ils doivent avoir une résistance à l'écoulement uniquement jusqu'à ce que le liquide ait été entièrement distribué dans la microchambre suivante. Cela signifie également que la limitation du nombre possible de microchambres distribuées a été supprimée grâce à la mise en œuvre de la valve à prise d'air pour S2.

La figure 5b–d montre que les 10 microchambres ont été remplies séquentiellement avec de l'eau contenant du colorant alimentaire vert (0,1 % p/v) à des débits de 10, 30 et 70 μL/min (Vidéo S2). Ainsi, la valve enfichable d'air a permis une distribution réussie dans les 10 microchambres à des débits inférieurs à 70 μL/min. Selon la contrainte donnée par l'Eq. (5a), le débit maximal admissible théorique est limité à environ 70 µL/min pour la distribution de 10 microchambres compte tenu des dimensions géométriques des microcanaux et de la paire de vannes d'arrêt passives dans la conception utilisée dans cette étude. Ainsi, les résultats expérimentaux concordaient de manière satisfaisante avec le débit maximal autorisé théoriquement prédit. Le débit admissible obtenu avec la mise en œuvre de la vanne à prise d'air était sept fois supérieur à celui obtenu avec l'agencement de vannes précédent utilisant des vannes d'arrêt à double face et 14 fois supérieur à celui obtenu avec les vannes d'arrêt à simple face utilisées dans notre étude précédente (le débit maximal autorisé était de 5 μL/min pour 10 microchambres)37. Notamment, l'amélioration spectaculaire de la résistance à la pression des vannes d'arrêt permanent nous a permis d'introduire le liquide manuellement dans le dispositif microfluidique (Vidéo S3 ; débit moyen estimé : ~ 40 µL/min).

De manière inattendue, nous avons observé que le ménisque liquide-air, qui avait auparavant été épinglé par la valve à enfichage d'air, fuyait progressivement en aval et, au niveau de la première microchambre, à la fois en amont et en aval, au fur et à mesure de la distribution (flèches jaunes sur la Fig. 5b – d). Ce comportement de fuite de vanne inattendu était très probablement dû à la perméabilité au gaz du PDMS42. La longueur de fuite (LL) semble augmenter non seulement avec une position de plus en plus amont de la vanne dans le dispositif, mais également avec une augmentation du débit. La figure 6a montre LL au niveau de la vanne d'enfichage d'air en aval de chaque microchambre à des débits de 10 à 70 µL/min. Les valeurs de LL ont été estimées juste après le remplissage complet de la 10ème microchambre. LL a progressivement diminué au fur et à mesure que les valves étaient situées plus en aval jusqu'à ce qu'elle atteigne 0,8 mm, après quoi elle a diminué avec une pente négative plus importante. Cinq paires de S2 ont été disposées en série dans le microcanal d'échappement d'air, ce qui a donné une longueur totale de 0, 8 mm entre le bord arrière de la première structure convexe de valve (réglé sur la position zéro de LL) et le bord arrière de la cinquième valve (Fig. 5a). La région de transition près de LL = 0,8 mm était très probablement due aux différences géométriques dans le microcanal, c'est-à-dire aux fluctuations périodiques de la largeur du microcanal dues aux structures convexes en vis-à-vis intégrées sur les deux parois latérales du microcanal.

Analyse expérimentale de la longueur de fuite (LL). (a) Valeurs LL au niveau de la vanne d'enfichage d'air en aval de chaque microchambre à des débits de 10 à 70 µL/min. Les symboles ouverts et solides dans le graphique représentent les données des dispositifs microfluidiques PDMS scellés avec du ruban adhésif double face à base de silicone et liés de manière covalente à une fine couche PDMS, respectivement. (b) Les données du dispositif PDMS qui était lié de manière covalente à une fine couche de PDMS enduite sur une plaquette de verre de 4 pouces ont été retracées en fonction du produit de la pression interne (P) appliquée à chaque prise d'air et du logarithme naturel du temps (ln(t)).

Pour étudier l'effet des fuites d'air à l'interface du dispositif PDMS et du ruban adhésif double face à base de silicone, nous avons préparé un dispositif PDMS modifié qui a été lié de manière covalente à une fine couche de PDMS enduite sur une plaquette de verre de 4 pouces par traitement de surface au plasma d'air. Les valeurs LL mesurées pour le dispositif PDMS modifié sont également tracées sur la figure 6a. On peut voir qu'il n'y avait pas de différence significative entre les deux types d'appareils. Ainsi, une fuite d'air négligeable s'est produite à l'interface entre le dispositif PDMS et le ruban adhésif. De plus, bien que toutes les vannes enfichables d'air S2 aient été soumises à une pression appliquée décrite dans l'Eq. (5b) juste après la fin du piégeage de l'air entre les vannes adjacentes, le bouchon d'air emprisonné entre les première et deuxième microchambres présentait une pression interne plus élevée que tout autre bouchon d'air situé en aval (Fig. S3), c'est-à-dire que la pression interne augmentait avec une augmentation du nombre de microchambres qui avaient été distribuées, selon l'équation. (1). Par conséquent, LL peut être considéré comme augmentant non seulement au niveau des vannes à prise d'air situées plus en amont, mais également à un débit plus élevé en raison d'une augmentation de la résistance à l'écoulement qui peut être estimée par l'équation. (2).

Sur la figure 6b, les données du dispositif PDMS lié de manière covalente à une fine couche de PDMS enduite sur une plaquette de verre de 4 pouces sont retracées en fonction du produit de la pression interne (P) appliquée à chaque bouchon d'air et le logarithme naturel du temps (ln (t)). P a été théoriquement calculé selon l'Eq. (1), et t a été déterminé expérimentalement comme le temps total écoulé entre l'achèvement d'un certain bouchon d'air et le remplissage complet des 10 microchambres avec de l'eau. Les données sont répertoriées dans le tableau S1 dans les informations supplémentaires. Comme le montre le graphique, dans les conditions de LL ≥ 0,8 mm, LL est exprimé quel que soit le débit et la position de la vanne comme suit :

où le coefficient de détermination (R2) a été estimé à 0,823, indiquant que l'hypothèse présentée dans l'Eq. (6) est valide. Par conséquent, nous pouvons théoriquement prédire LL même pendant le processus de conception de dispositifs microfluidiques. Il convient de noter que, lorsque le pompage a arrêté le flux de liquide dans le dispositif microfluidique, le tube d'entrée a été retiré et la fuite de liquide au niveau des vannes d'enfichage d'air a été considérablement réduite car la pression interne dans le microcanal et les microchambres diminue immédiatement à la pression atmosphérique. Un moyen fondamental de résoudre le problème des fuites consiste à remplacer le PDMS par des plastiques techniques à faible perméabilité aux gaz, tels que le polyméthacrylate de méthyle, le polycarbonate ou le polymère cyclo-oléfine.

Nous avons exploré la possibilité de la détection rapide et simultanée de plusieurs substances allergènes alimentaires, c'est-à-dire des cibles d'ADN spécifiques du blé (T. aestivum), du sarrasin (F. esculentum) et de l'arachide (A. hypogaea), par la méthode colorimétrique LAMP utilisant un dispositif microfluidique avec une disposition circulaire. Dans le but de fournir un dispositif de diagnostic microfluidique pour la détection génétique simultanée de sept allergènes dans les aliments transformés, nous avons logé de manière compacte 10 microchambres en cercle au lieu d'utiliser un format à une seule rangée. Comme le montre la Fig. 7, dans un dispositif avec une disposition circulaire, de l'eau de couleur verte (0,1 % p/v) pourrait être distribuée avec succès de manière séquentielle dans toutes les microchambres à un débit de 30 µL/min (Vidéo S4). Notre méthode de distribution séquentielle de liquide offre une flexibilité substantielle dans la conception des dispositifs microfluidiques, permettant ainsi la conception géométrique de 10 microchambres disposées en cercle et logées de manière compacte dans le diamètre extérieur de 20 mm formé par le microcanal d'échappement d'air. Les dimensions géométriques de ce type de dispositif ont été conçues comme L1 = 1,52 mm, L2 = 0,80 mm et L3 = 0,89 mm. Le débit maximal autorisé théorique pour la distribution d'eau dans les 10 microchambres a été estimé inférieur à 160 µL/min, les distances d'écart étaient g1 = 40,5 μm et g2 = 21,4 μm pour les vannes S1 et S2, respectivement, le rayon d'angle au bord arrière des structures convexes était r1 = r2 = 6,4 µm, et la largeur et la hauteur du microcanal étaient W = 202,1 µm et H = 59,0 µm, respectivement.

Dispositif microfluidique PDMS de conception optimale avec 10 microchambres de réaction (~ 3 µL chacune) disposées en cercle et logées de manière compacte dans le diamètre extérieur de 20 mm formé par le microcanal d'échappement d'air, utilisé pour la détection génétique multiplexée des allergènes alimentaires. Toutes les microchambres ont été remplies séquentiellement d'eau de couleur verte à un débit de 30 µL/min.

La figure 8a montre un résultat expérimental pour la détection d'ADN spécifique au blé (concentration totale d'ADN : 1,0 ng/µL) par la méthode colorimétrique LAMP à l'aide du dispositif microfluidique. Une fois que l'échantillon d'ADN de blé mélangé aux réactifs LAMP a été introduit dans le dispositif, le test LAMP a été effectué dans un bain d'eau chaude à 60 ° C pendant 60 min. Comme prévu, des réactions positives, manifestées par un changement de couleur de HNB (150 µM) dans la solution de réaction LAMP du violet au bleu ciel, ont été clairement observées dans les chambres 2, 5, 7 et 10, sans résultats faux positifs et faux négatifs. Les tests LAMP avec de l'ADN de sarrasin et de l'ADN d'arachide ont donné des résultats vrais positifs dans les chambres 3 et 8 (Fig. S4a supplémentaire) et 4 et 9 (Fig. S4b), respectivement, ainsi que dans les chambres 5 et 10 utilisées comme contrôle positif.

Photographies prises avec une caméra de smartphone montrant la détection colorimétrique de (a) l'ADN de blé (n° 2 et 7), (b) un mélange d'ADN de blé et de sarrasin (n° 3 et 8), (c) un mélange d'ADN de blé, de sarrasin et d'arachide (n° 4 et 9) et (d) l'ADN de théier comme contrôle négatif, par des tests LAMP exécutés à 60 ° C pendant 60 min. Des ensembles d'amorces universelles pour identifier toutes les espèces végétales ont été pré-répertoriés dans les chambres n° 5 et 10 en tant que contrôle positif, alors qu'aucune amorce n'a été pré-répertoriée dans les chambres n° 1 et 6 en tant que contrôle négatif.

La figure 8b montre la détection simultanée de plusieurs allergènes alimentaires dans un mélange d'ADN de blé et d'ADN de sarrasin (concentration totale d'ADN : 1,0 ng/µL chacun) par le test LAMP ; des réactions positives se sont produites dans les chambres 2, 3, 5, 7, 8 et 10, sans aucune contamination croisée. Les tests LAMP multiplexés avec d'autres combinaisons d'échantillons d'ADN, c'est-à-dire des mélanges d'ADN de blé et d'ADN d'arachide (Fig. S4c) et d'ADN de sarrasin et d'ADN d'arachide (Fig. S4d), ont également donné de vrais résultats de test. De même, un mélange des trois échantillons d'ADN (1,0 ng/µL chacun) a donné des réactions positives dans toutes les chambres à l'exception des chambres 1 et 6, utilisées comme contrôle négatif (Fig. 8c). En revanche, lorsque l'ADN extrait d'un théier (1,0 ng/µL) a été introduit dans l'appareil, un changement de couleur du violet au bleu ciel a été observé uniquement dans les chambres de contrôle positif (n° 5 et 10), sans réactions faussement positives dans les autres chambres (Fig. 8d).

La figure 9 montre les distributions des différences de couleur tracées dans le plan chromatique a * - b * de l'espace CIELAB à partir des résultats LAMP présentés sur la figure 8 (de même, les données présentées sur la figure S4 sont tracées sur la figure supplémentaire S5). Le résultat a révélé que les couleurs des groupes positifs et négatifs étaient clairement séparées après que les tests LAMP aient été exécutés pendant 60 min, pour toute combinaison des trois allergènes alimentaires et du théier utilisés comme contrôle négatif.

Les distributions de couleur pour les réactions LAMP positives (bleu ciel) et négatives (violet) (illustrées à la Fig. 8) sont exécutées pour la détection de trois allergènes alimentaires (blé, sarrasin et arachide) et du théier comme témoin négatif, tracées dans le plan chromatique a * -b * de l'espace colorimétrique CIELAB. Les réactions LAMP ont été effectuées à 60 ° C pendant 60 min.

Dans le but d'améliorer les performances des dispositifs microfluidiques à base de PDMS utilisés pour le diagnostic génétique multiplexé rapide et facile à utiliser, nous avons proposé une configuration de valve nouvellement conçue, appelée valve enfichable d'air. Les performances de résistance à la pression de la vanne enfichable d'air ont été remarquablement améliorées après l'achèvement du piégeage de l'air entre les vannes en vis-à-vis. En remplaçant l'agencement de vannes précédent utilisant des vannes d'arrêt à double face par des vannes à prise d'air, qui servaient de vanne d'arrêt permanente, le débit maximal autorisé a considérablement augmenté jusqu'à 14 fois (~ 70 µL/min) pour la distribution séquentielle d'un liquide pour remplir un réseau de 10 microchambres de réaction. En outre, la limitation du nombre possible de microchambres distribuées a été supprimée par la mise en œuvre de la valve à enfichage d'air. Nous avons démontré que le dispositif microfluidique fabriqué permet la détection simultanée de trois allergènes alimentaires végétaux (blé, sarrasin et arachide) par des essais colorimétriques LAMP exécutés à 60 oC pendant 60 min en une seule opération, sans contamination croisée entre les microchambres de réaction. Il convient de noter que le dispositif de diagnostic pourrait être conçu avec une configuration géométrique de 10 microchambres de réaction disposées en cercle et logées de manière compacte dans un diamètre extérieur de 20 mm, car notre méthode de distribution séquentielle de liquide offre une flexibilité substantielle dans la conception des dispositifs microfluidiques.

Dans les études futures, pour simplifier le mode opératoire, nous développerons davantage non seulement une méthode pour pré-stocker les réactifs LAMP dans le dispositif microfluidique, mais également un dispositif microfluidique sans pompe basé sur une combinaison de pompage centrifuge et de valve capillaire, sans avoir besoin d'un système de pompage externe (c'est-à-dire une seringue ou une pompe à pression). L'objectif final est de développer une plate-forme de diagnostic échantillon-réponse rapide et facile qui permet la détection simultanée non seulement des sept ingrédients allergènes qui doivent être étiquetés en vertu de la loi japonaise, c'est-à-dire le blé, le sarrasin, l'arachide, l'œuf, le lait, les crevettes et le crabe, mais aussi les agents pathogènes d'origine alimentaire (par exemple, Salmonella enterica, S. aureus, Campylobacter jejuni et E. coli O157:H7) à l'aide de notre dispositif microfluidique, pour assurer la sécurité alimentaire. En principe, il est possible de personnaliser de manière flexible le type de cible d'acide nucléique d'intérêt (ADN/ARN) ; ainsi, cette technologie très polyvalente peut être appliquée à la détection génétique multiplexée sur site non seulement des allergènes, mais également des maladies infectieuses causées par divers agents pathogènes (virus, bactéries, champignons et parasites), des plantes vénéneuses et des drogues illégales, sans nécessiter d'opérations laborieuses et multiples.

Toutes les données pertinentes pour l'étude sont incluses dans l'article ou téléchargées en tant qu'informations supplémentaires.

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Cette recherche a été partiellement soutenue par le programme de transfert de technologie adaptable et homogène par le biais de la R&D axée sur les objectifs (A-STEP) de l'Agence japonaise pour la science et la technologie (JST) sous le numéro de subvention JPMJTM20EG, et le projet coopératif pour la recherche innovante de l'Université de technologie de Toyohashi, au Japon. Les auteurs tiennent à remercier Editage (www.editage.com) pour l'édition en anglais.

Département de génie mécanique, Université de technologie de Toyohashi, Toyohashi, Aichi, 441-8580, Japon

Daigo Natsuhara, Ryogo Saito, Koki Shirai, Shunya Okamoto, Moeto Nagai et Takayuki Shibata

Faculté de pharmacie et des sciences pharmaceutiques, Université Josai, Sakado, Saitama, 350-0295, Japon

Sae Misawa et Masashi Kitamura

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Tous les auteurs ont également contribué au manuscrit. DN : méthodologie, enquête, rédaction—préparation du projet original, SM : méthodologie, enquête, RS : méthodologie, enquête, KS : méthodologie, enquête, SO : rédaction—révision et édition, supervision, MN : rédaction—révision et édition, supervision, MK : rédaction—révision et édition, supervision, acquisition de financement, TS : conceptualisation, rédaction—révision et édition, supervision, administration du projet acquisition de financement.

Correspondance à Daigo Natsuhara ou Takayuki Shibata.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Natsuhara, D., Misawa, S., Saito, R. et al. Dispositif de diagnostic microfluidique avec vannes à prise d'air pour la détection génétique simultanée de divers allergènes alimentaires. Sci Rep 12, 12852 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-16945-2

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Reçu : 27 mars 2022

Accepté : 19 juillet 2022

Publié: 27 juillet 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-16945-2

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